RNA測序

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File:Summary of RNA-Seq.svg
RNA-Seq概述，包括：樣本準備、上機測序、生信數據處理與分析。
In vivo：在生物體內，基因被轉錄，並在（真核生物中）經過剪接，最終產生成熟的mRNA轉錄本（紅色）。
In vitro：隨後從生物體中提取mRNA，將其片段化併合成（逆轉錄加雜合鏈轉換）穩定的雙鏈cDNA（藍色）。接着利用高通量短讀測序法，對雙鏈cDNA進行測序。
In silico：最後，將這些序列與參考基因組序列進行比對，從而重建並確定哪些基因組區域發生了轉錄。此類數據可用於註釋表達基因的位置、其相對表達水平以及各種可變剪接變體[1]。

RNA測序（RNA sequencing，RNA-seq[2][3]）或核糖核酸測序，是指分析特定RNA片段的鹼基序列，也就是腺嘌呤（A）、尿嘧啶（U）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）的排列方式。

全轉錄物組測序（whole transcriptome sequencing，WTS[4][5]），相對於全基因組定序（WGS），是利用高通量測序技術，檢測並獲得細胞或組織在特定功能狀態下所轉錄的所有RNA產物序列的方法[6]，屬於一種狹義的RNA測序。WTS基於第二代測序技術的轉錄組學研究方法，使用第二代測序的能力，在給定時刻從一個基因組中，揭示RNA的存在和數量的一個快照[7]。

首先提取生物樣品的全部轉錄的RNA，然後反轉錄為c-DNA後進行的二代高通量測序，在此基礎上進行片段的重疊組裝，從而可得到一個個的轉錄本。進而可以形成對該生物樣品當前發育狀態的基因表達狀況的全局了解（global）。進一步說，若和下一階段的生物樣品的RNA-Seq轉錄組進行比較，則可以得到全部的（在轉錄層面）基因表達的上調及下調—這就形成了表達譜，針對關鍵基因則可以形成你要想要的通路（pathway）的構建。

介紹[編輯]

相較於一個靜態的染色體而言，細胞內的轉錄物組是一個處於不斷變化的動態過程。隨着現在的次世代基因測序（NGS）技術的發展，使得可測得的DNA鹼基覆蓋面增加且樣本輸出的吞吐量增大。有助於對細胞內RNA轉錄物進行測序，提供包括選擇性剪接的轉錄、轉錄後的修飾、基因融合、突變/SNPs以及基因表達量改變等細節[8]。，RNA測序不僅能檢測mRNA的轉錄，還能觀測到包括總RNA和小RNA（miRNA、tRNA和核糖體RNA）在內不同尺度的RNA表達譜[9]。RNA測序還能用來確定外顯子/內含子的邊界，修正之前註釋的5'和3'端基因邊界。未來的RNA測序研究還包括觀察感染時細胞傳導路徑的變化[10]和癌症中不同基因表達程度[11]。下一代基因測序之前，對轉錄物組學和基因表達的研究主要基於基因表達晶片（微陣列），後者包含數以千計用於探測靶向序列的DNA探針，可以得到所有表達出轉錄物的表達譜。基因表達晶片之後，Template:Le（SAGE）是主要的基因分析技術。 相較於一個靜態的染色體而言，細胞內的轉錄物組是一個處於不斷變化的動態過程。隨着現在的次世代基因測序（NGS）技術的發展，使得可測得的DNA鹼基覆蓋面增加且樣本輸出的吞吐量增大。有助於對細胞內RNA轉錄物進行測序，提供包括選擇性剪接的轉錄、轉錄後的修飾、基因融合、突變/SNPs以及基因表達量改變等細節[8]。，RNA測序不僅能檢測mRNA的轉錄，還能觀測到包括總RNA和小RNA（miRNA、tRNA和核糖體RNA）在內不同尺度的RNA表達譜[9]。RNA測序還能用來確定外顯子/內含子的邊界，修正之前註釋的5'和3'端基因邊界。未來的RNA測序研究還包括觀察感染時細胞傳導路徑的變化[10]和癌症中不同基因表達程度[12]。下一代基因測序之前，對轉錄物組學和基因表達的研究主要基於基因表達晶片（微陣列），後者包含數以千計用於探測靶向序列的DNA探針，可以得到所有表達出轉錄物的表達譜。基因表達晶片之後，Template:Le（SAGE）是主要的基因分析技術。

相對於RNA測序，基因表達晶片（微陣列）測序結果的覆蓋面很窄，只能覆蓋染色體中1千多萬SNP中的常見等位基因的SNP（50萬到200萬）。因此，現有數據庫中一般沒有罕見等位基因的測序結果，而只有常見的SNP的數據，這對研究者來說是一個重大缺陷。很多癌症源於突變概率小於1%的突變，因而很難被檢測出。但是，基因表達晶片（微陣列）測序在已知的等位基因檢測中仍很重要，使它們非常適合監管機構批准的診斷，如囊性纖維化。

分析[編輯]

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File:RNASeqWorkflow2016.png
Diagram outlining the RNASeq analyses described in this section

轉錄體組裝[編輯]

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有兩種方法用於將原始序列讀數分配給基因體特徵（即組裝轉錄體）：

  • De novo: 這種方法不需要參考基因體來重建轉錄體，通常基因體未知、不完整或與參考基因體相比有顯著不同時使用[13]。短讀長序列進行de novo組裝時的挑戰包括：(1) 確定哪些序列應連接成連續序列（重疊序列群, contigs）(2) 定序錯誤和其他人為的穩定性 (3) 計算效率。使用在de novo組裝的主要演算法是從重疊圖轉換而來，稱為de Bruijn圖，其將序列讀長切分為長度k的序列並將所有k-mer轉存成雜湊表[14]。使用de Bruijn圖做組裝的工具有 Velvet[15]、Trinity[13]、Oases[16]和 Bridger[17]。同一樣品的雙端序列和長序列讀長可作為模板或骨架來彌補短讀長序列的缺陷。評估de novo組裝品質的指標包括重疊序列群長度的中位數、重疊序列群數量和 腳本錯誤：沒有「ilh」這個模塊。[18]。
File:RNA-Seq-alignment.png
RNA-seq mapping of short reads in exon-exon junctions. The final mRNA is sequenced, which is missing the intronic sections of the pre-mRNA.
  • 引導式組裝：這種方法使用與DNA比對相同的方式，比對序列至參考基因體的非連續部分則需要額外的計算複雜度[19]。這些非連續序列讀數是對剪接產物進行定序的結果（如圖）。通常比對演算法分為兩個步驟：(1) 對齊序列較短的部分 (seed) (2) 使用 動態規劃 來找到最佳比對，有時結合已知的註釋。使用基因體引導比對的工具包括 Bowtie[20]TopHat（基於Bowtie結果對齊剪接點）[21][22]、Subread[23]、STAR[19]、HISAT2[24]、Sailfish[25]、Kallisto[26]和 GMAP[27]。基因體引導式組裝的品質可以藉由以下兩者來測量：(1) de novo組裝指標（如N50）2）使用精確度、召回率或它們的組合（如F1 score）（與已知的轉錄本、剪接點、基因體和蛋白質序列比較）[18]。此外，可以使用模擬序列讀數的方式進行電腦模擬評估[28][29]。

關於組裝品質的說明：目前的共識是：1) 組裝品質會因所採用的指標而異；2) 在某個物種中表現優異的組裝工具，未必能在其他物種中同樣表現出色；以及 3) 結合不同的方法可能是最可靠的。[30][31][32]

參考文獻[編輯]

  1. ↑ Template:Cite journal
  2. ↑ Ayturk U. RNA-seq in Skeletal Biology. Curr Osteoporos Rep. 2019;17(4):178-185. doi:10.1007/s11914-019-00517-x
  3. ↑ Simoneau J, Dumontier S, Gosselin R, Scott MS. Current RNA-seq methodology reporting limits reproducibility. Brief Bioinform. 2021;22(1):140-145. doi:10.1093/bib/bbz124
  4. ↑ Esmeray Sönmez E, Hatipoğlu T, Kurşun D, et al. Whole Transcriptome Sequencing Reveals Cancer-Related, Prognostically Significant Transcripts and Tumor-Infiltrating Immunocytes in Mantle Cell Lymphoma. Cells. 2022;11(21):3394. Published 2022 Oct 27. doi:10.3390/cells11213394
  5. ↑ Meggendorfer M, Walter W, Haferlach T. WGS and WTS in leukaemia: A tool for diagnostics?. Best Pract Res Clin Haematol. 2020;33(3):101190. doi:10.1016/j.beha.2020.101190
  6. ↑ Template:術語在線
  7. ↑ Template:Cite journal
  8. ↑ 8.0 8.1 Template:Cite journal
  9. ↑ 9.0 9.1 Template:Cite journal
  10. ↑ 10.0 10.1 Template:Cite journal
  11. ↑ Template:Cite journal
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外部連結[編輯]

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